最近收到客戶反饋“正常挑單菌培養(yǎng)的DH5α質(zhì)粒菌提取的質(zhì)粒濃度突然變的好低，是不是試劑盒配方有改動(dòng)？”。Simgen作為通過(guò)ISO質(zhì)量體系認(rèn)證的生產(chǎn)企業(yè)，試劑配方若有變動(dòng)，研發(fā)部、質(zhì)量部、生產(chǎn)部、銷售部都會(huì)收到文件通知。既然沒(méi)有相關(guān)的文件通知，我們就向客戶索要了培養(yǎng)好的質(zhì)粒菌（K3-1、K3-22）及使用的試劑盒，并使用公司自己培養(yǎng)的質(zhì)粒菌（Simgen-1、Simgen-2）進(jìn)行測(cè)試對(duì)照。

材料與方法：

Singen實(shí)驗(yàn)室質(zhì)粒菌培養(yǎng)方法：挑取單菌落到10 ml的LB液體（100 μg/ml氨芐濃度）培養(yǎng)基中，37℃、180 rpm過(guò)夜培養(yǎng)約16小時(shí)。每管收集2 ml菌液。

客戶培養(yǎng)好的質(zhì)粒菌（K3-1、K3-22）：每管收集2 ml菌液。

試劑盒：客戶實(shí)驗(yàn)室?guī)Щ氐?/span>Simgen快速質(zhì)粒DNA小量試劑盒，產(chǎn)品批號(hào)：20240429

測(cè)試方法：按說(shuō)明書操作步驟提取質(zhì)粒DNA后測(cè)質(zhì)粒DNA濃度，并電泳觀察DNA帶型。

測(cè)試結(jié)果：

質(zhì)粒提取濃度如下：

1：K3-1；2：K3-22；3：Simgen-1；4：Simgen-2；M：DL2000-G DNA Ladder（Simgen. Cat. No. MD1006-G）。1%瓊脂糖凝膠電泳，120 V 30 min。1和2電泳上樣量均為20 μl，3和4上樣量為1 μl。

討論與分析：

1） 從分光光度計(jì)測(cè)得的數(shù)據(jù)分析： Simgen兩管質(zhì)粒菌提取濃度及數(shù)值均在正常范圍內(nèi)，客戶提供的質(zhì)粒菌提取的質(zhì)粒DNA濃度明顯偏低，與客戶描述相符。

2） 電泳結(jié)果分析：Simgen-1、Simgen-2質(zhì)粒DNA條帶正常；K3-1、K3-22提取到質(zhì)粒，只有marker最上方基因組條帶對(duì)應(yīng)位置有暗淡的條帶，說(shuō)明沒(méi)有提取到質(zhì)粒，樣本濃度顯示的應(yīng)該是提取到的微量基因組DNA的濃度。

由于客戶給的菌液完全沒(méi)有提取到質(zhì)粒，詢問(wèn)客戶后得知這兩種質(zhì)粒都是氨芐抗性的，于是我們將剩余的兩種菌液在氨芐抗性平板上劃線，過(guò)夜培養(yǎng)后重新挑單菌于3 ml LB培養(yǎng)基（100 μg/ml氨芐濃度）中培養(yǎng)7小時(shí)。收集1 ml菌液中的菌體重新進(jìn)行質(zhì)粒提取，特別仔細(xì)觀察并記錄了實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)有以下現(xiàn)象不正常：加入Buffer Ⅱ顛倒數(shù)次，液體顯示有少許粘稠但未呈現(xiàn)透明狀，相反呈現(xiàn)混濁狀。加入Buffer N8顛倒數(shù)次，黃色的沉淀無(wú)法皺縮，始終呈水泡狀，離心沉淀無(wú)法完全沉到底部，將上層較少的上清液加入核酸純化柱，繼續(xù)后續(xù)操作，提取濃度如下：

將提取的質(zhì)粒進(jìn)行電泳，同樣顯示沒(méi)有提取到質(zhì)粒。

K3-1、K3-22、M：DL5000。1%瓊脂糖凝膠電泳，120 V 30 min。1和2電泳上樣量均為20 μl。

結(jié)論如下：

1) 該菌能在含有氨芐青霉素的的平板上正常生長(zhǎng)并形成單菌落，但是不能被Buffer II 試劑溶解（注意：正常的大腸桿菌能被Buffer II試劑溶解，菌體溶解后呈透明狀）。

2) 對(duì)比菌的生長(zhǎng)速度，該菌1 ml菌液離心獲得的菌體沉淀大小相當(dāng)于5 ml 大腸桿菌菌液獲得的菌體沉淀大小，推測(cè)該菌生長(zhǎng)速度較快或是單個(gè)菌菌體的體積較大所導(dǎo)致。

3) 對(duì)比了菌液氣味，發(fā)現(xiàn)該菌液的氣味與同步培養(yǎng)的DH5α宿主菌的質(zhì)粒菌液氣味明顯不同，該菌有類似酵母菌生長(zhǎng)的氣味。

綜上所述，我們判斷在平板上生長(zhǎng)的不是含質(zhì)粒的大腸桿菌，而是真菌。考慮到加入Buffer Ⅱ后溶液有稍微變粘稠狀，也不排除平板中的單菌落是由真菌和不含質(zhì)粒的大腸桿菌混合而成的菌落的可能性，解釋為由于真菌不懼抗生素菌落長(zhǎng)得較大，無(wú)質(zhì)粒的大腸桿菌在有抗生素的平板中無(wú)法單獨(dú)形成菌落，只能隱藏在真菌菌落中。

后續(xù)我們特別走訪了客戶的實(shí)驗(yàn)室，并現(xiàn)場(chǎng)與客戶溝通，發(fā)現(xiàn)客戶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和涂平板的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有在超凈臺(tái)進(jìn)行無(wú)菌操作，而是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)直接操作的。因此我們大致可以推測(cè)可能是室內(nèi)的真菌污染了轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的平板。需要注意的是大部份的抗生素作用機(jī)理是根據(jù)真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)差異來(lái)抑制或殺滅細(xì)菌的，所以很多抗生素對(duì)酵母菌等真菌無(wú)效。以氨芐青霉素為例，其作用靶點(diǎn)是細(xì)菌細(xì)胞壁的合成過(guò)程，真菌與細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完全不同，因此氨芐青霉素對(duì)真菌的生長(zhǎng)抑制無(wú)效。

所以最后我們總結(jié)一下：分子生物學(xué)中的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、接種實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)條件具備的前提下，必須在無(wú)菌的超凈臺(tái)中，靠近酒精燈火焰周圍進(jìn)行操作。若無(wú)超凈工作臺(tái)，則實(shí)驗(yàn)必須在點(diǎn)燃的酒精燈火焰的5~10 cm周圍處進(jìn)行轉(zhuǎn)化或涂布以及接種等實(shí)驗(yàn)。

本次的實(shí)驗(yàn)探索也讓我們了解到一個(gè)現(xiàn)象：即便我們從不含質(zhì)粒的菌液中提取質(zhì)粒DNA，也是能測(cè)到一定的DNA濃度的，只是濃度嚴(yán)重偏低。這是因?yàn)樵谫|(zhì)粒DNA的提取過(guò)程中，并不是完全沒(méi)有細(xì)菌的基因組DNA和RNA殘留的，分光光度計(jì)顯示的DNA濃度就是這些殘留的細(xì)菌基因組DNA和RNA的濃度。當(dāng)提高提取到的DNA的電泳上樣量后，就可觀察到暗淡的基因組條帶（RNA由于片段太小，一般情況下觀察不到）。正因如此，同學(xué)們?cè)谔崛≠|(zhì)粒DNA的時(shí)候，如果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA濃度嚴(yán)重偏低，不要簡(jiǎn)單地判斷細(xì)菌長(zhǎng)得不好，或者試劑盒的質(zhì)量問(wèn)題，一定要將提取的質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳驗(yàn)證，否則就可能離真相越來(lái)越遠(yuǎn)。